Nature Communications | 不影響化療效果且催化活性可調(diào)節(jié)的CeO2納米顆粒阻止化療引起的急性腎損傷
發(fā)布時(shí)間：2021-07-09 15:45:08 人氣：3367
導(dǎo)語
急性腎損傷（AKI）作為腫瘤化療引起的普遍且致命副作用，嚴(yán)重影響化療的癌癥病人。AKI主要表現(xiàn)為由ROS引起的腎細(xì)胞的相關(guān)損傷。降低ROS可以減少療引起的AKI，與此同時(shí)也會(huì)降低化療效果。小分子的抗氧化劑N-acetyl cysteine(NAC)是降低氧化損傷對(duì)抗化療引起的AKI的一種方式；鉬基多氧甲酸納米團(tuán)簇作為一種納米抗氧化劑可在腎臟中聚集，用以有效保護(hù)腎臟；DNA origami的納米結(jié)構(gòu)也被證實(shí)具有ROS清除能力，用以保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)并改善AKI。然而這類小分子和納米材料的抗氧化作用也會(huì)降低腫瘤組織的氧化應(yīng)激，將會(huì)刺激腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，因而阻礙它們?cè)诨熞鸬?/span>AKI上的應(yīng)用。
鑒于此，浙江大學(xué)凌代舜課題組在《Nature Communication》上發(fā)表了Catalytic activity tunable ceria nanoparticles prevent chemotherapy-induced acute kidney injury without interference with chemotherapeutics為題的研究，該研究設(shè)計(jì)了一種催化活性可調(diào)的二氧化鈰納米粒子（CNPs），可以防止化療引起的 AKI，但不會(huì)干擾化療作用。具體來說，在腎皮層中性環(huán)境中CNP催化分解H2O2，然后通過激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路來調(diào)節(jié)與ROS有關(guān)的基因表達(dá)，恢復(fù)ROS平衡保護(hù)腎小管；在腫瘤酸性微環(huán)境下，CNP由于高濃度的H+破壞了其活性催化位點(diǎn)進(jìn)而限制其的抗氧化作用，從而不干擾化療生成的ROS來殺死癌細(xì)胞。作為 ROS調(diào)節(jié)劑，CNP這種條件依賴型可調(diào)的催化活性，在癌癥患者的 AKI 臨床預(yù)防和治療方面具有巨大潛力。
圖1 CNPs在小動(dòng)物體內(nèi)不同組織中由于不同pH而顯示出不同功能的示意圖。
01
CNPs的合成和表征
研究者們采用一種改良的反向微膠團(tuán)方法合成了直徑約3 nm疏水CNPs，并且對(duì)其表現(xiàn)進(jìn)行DSPE-PEG2K修飾。CNPs的水合動(dòng)力學(xué)直徑為9.7 nm，電勢(shì)為-20.4 mV。XPS表明了Ce3+和Ce4+共存。CNPs引起H2O2的降解符合米氏動(dòng)力學(xué)方程。Km在中性條件下比酸性條件下低1.4倍，Vmax高2.1倍。XRD結(jié)果表明CNPs可調(diào)節(jié)的活性不是基于晶體結(jié)構(gòu)的改變。H2O2+2Ce4+→O2+2H++2Ce3++Vo，在酸性環(huán)境中Ce3+可以再回到Ce4+，重新形成活性位點(diǎn)，而非活化的CNP(iCNP)，H2O2和H+滲透的CNPs失去抗氧化活性，且很難逆轉(zhuǎn)。
圖1(a)氯仿中超微CNPs的TEM圖像；(b)經(jīng)DSPE-PEG修飾后的CNPs水相中TEM圖像，其中內(nèi)插圖DLS數(shù)據(jù)表明DSPE-PEG水合直徑分布為9.7nm；(c)CNPs在不同pH下分解H2O2的O2產(chǎn)生量；(d)在中性和酸性pH，CNPs與H2O2反應(yīng)下其不用時(shí)間的拉曼光譜；(e)CNPs pH環(huán)境依賴性表現(xiàn)出的類過氧化氫酶活性差異的化學(xué)模型示意圖。
02
CNPs條件依賴性的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)
順鉑（DDP）是廣泛使用的抗實(shí)體腫瘤藥物，具有腎毒性，究其原因是腎上皮細(xì)胞是DDP誘導(dǎo)腎毒性的主要目標(biāo)。使用HK-2細(xì)胞和ES-2細(xì)胞來研究CNPs對(duì)腎臟的pH依賴的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)表明：在pH7.4時(shí)CNP明顯降低了DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，在pH=6.6或pH=6.0時(shí)卻不受影響；而小分子抗毒劑NAC在pH=6.6時(shí)仍具有抗毒性。在其它腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中，如腫瘤細(xì)胞OVCAR8，HepG2，A549和正常的LO2細(xì)胞，CNPs均表現(xiàn)出pH依賴的抗DDP毒的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。此外CNPs在HK-2細(xì)胞和ES-2細(xì)胞中也具有pH依賴的抗紫杉醇細(xì)胞毒性的作用。
圖2 (a-e) DDP處理，不同濃度的CNPs在不同pH條件下，對(duì)HK-2、ES-2、HepG2、A549以及OVCAR8存活率的影響；(f, g) 不同pH條件紫杉醇處理后HK-2和ES-2細(xì)胞的存活率。
03
體內(nèi)水平CNPs對(duì)抗化療引起的AKI作用分析
研究者們進(jìn)一步研究了CNPs的藥代動(dòng)力學(xué)及其在小鼠體內(nèi)的分布情況。組織學(xué)實(shí)驗(yàn)表明CNPs無明顯的細(xì)胞毒性。ICR小鼠腹腔注射DPP誘導(dǎo)AKI，同時(shí)分別靜脈注射生理鹽水、CNPs和iCNP，與正常小鼠相比，AKI小鼠中CNPs積累增強(qiáng)，且在腎上皮中具有更長的保留時(shí)間。生物電鏡顯示，腎髓質(zhì)中的腎小管上皮細(xì)胞纖毛、腎小球基底膜和腎小管上均存在CNPs。這可能與CNPs尺寸小（～3nm），PEG的可形變表面修飾，CNPs的表面負(fù)電荷和腎損傷的抗腎小球基底膜（GBM）滲透增強(qiáng)有關(guān)。在經(jīng)治療的小鼠的尿液中發(fā)現(xiàn)CNPs，這表明CNPs可通過GBM過濾到腎小管并通過尿液排出。包膜窖介導(dǎo)的胞吞作用在CNPs的攝取中發(fā)揮著重要作用。與腎損傷相關(guān)的血清血尿素氮（BUN）和肌氨酸（Cre）以及KIM-1的mRNA，在注射CNPs后的AKI小鼠中均表現(xiàn)為下降，H&E染色顯示CNPs治療有助于改善DDP治療的腎損傷。
圖3 (a) AKI小鼠治療處理和評(píng)估的示意圖；(b, c和d) 不同處理后BUN、Cre和KIM-1相關(guān)基因表達(dá)情況；(e) 不同處理后腎小管的損傷程度分析。
04
CNPs在AKI中的抗凋亡作用
研究者們通過CNPs對(duì)于細(xì)胞凋亡信號(hào)的影響，來探索CNPs減輕AKI的機(jī)理。經(jīng)DDP處理后，HK-2細(xì)胞凋亡率、PARP和caspase-3表達(dá)顯著增加，但再經(jīng)CNPs處理后這些相關(guān)因素顯著下降。因而認(rèn)為CNPs可顯著降低DDP引起的TUNEL凋亡水平。ROS是誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因素，CNPs可以清除DDP誘導(dǎo)的內(nèi)源ROS，逆轉(zhuǎn)DDP對(duì)于SOD的抑制和MDA的升高。qRT-PCR分析表明CNPs可以降低DDP處理后的HO-1基因表達(dá)，提高NOX2基因表達(dá)，使它們的表達(dá)接近無DDP處理的原始水平。
圖4 (a)細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)分析；(b) HK-2細(xì)胞中各種狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行量化；(c)蛋白印跡分析PARP和caspase-3表達(dá)情況；(d, e) TUNEL水平的染色圖和圖表；(f, g) HK-2細(xì)胞中ROS的流式細(xì)胞分析圖和圖表；(h-k) SOD活性，MDA水平，HO-1和NOX2相關(guān)基因表達(dá)情況。
05
CNPs對(duì)AKI保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制分析
Nrf2是ROS信號(hào)調(diào)控通路中的主要調(diào)控因子（ROS增多時(shí)，其表達(dá)減少），研究者利用western bolt檢測(cè)了CNPs處理前后Nrf2及相關(guān)蛋白DJ-1和Keap1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DJ-1和Nrf2表達(dá)上調(diào)，Keap1表達(dá)下調(diào)。Nrf2的敲除則會(huì)消除CNPs對(duì)于DDP產(chǎn)生的AKI的保護(hù)作用，也不能抑制凋亡相關(guān)的PARP和caspase-3表達(dá)水平，抗氧化類基因也對(duì)CNPs不再敏感。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明CNPs通過激活Nrf2降低ROS，并因此阻止細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)于腎細(xì)胞的保護(hù)。
圖5 (a, b-d) 經(jīng)不同處理后HK-2細(xì)胞中的Nrf2, Keap1和DJ-1蛋白質(zhì)印跡分析及量化；(e-h) 利用小干擾RNA負(fù)調(diào)Nrf2后通過western blot和qRT-PCR分析相關(guān)基因的表達(dá)情況；(i) CNPs通過激活Nrf2/Keap1，對(duì)抗DDP引起的氧化應(yīng)激的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖。
06
CNPs對(duì)于體內(nèi)總體化療效果的提高
相對(duì)于小分子藥物NAC（在腫瘤中也提高SOD活性，降低MDA水平）經(jīng)CNPs（在腫瘤中不改變SOD活性和不降低MDA水平）處理的荷瘤小鼠，治療期間小鼠體重變化波動(dòng)較小，且死亡率降低，能夠更大程度上增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤治療作用同時(shí)降低化療毒副作用。
圖6 (a) ES-2皮下瘤小鼠治療方式與評(píng)估示意圖；(b-g)不同處理的腫瘤體積、抑制效率和實(shí)體腫瘤大�。�(h, i)不同處理下小鼠的BUN和Cre的水平以及(j)不同處理下小鼠的存活率。
總結(jié)展望
綜上所述，AKI是一種與ROS相關(guān)的高死亡率的疾病，是化療產(chǎn)生的一種常見的毒副作用。小分子的抗氧化劑（NAC）在減弱AKI的同時(shí)，也會(huì)降低化療效果�；趐H依賴性活性可調(diào)的CNPs，在pH中性的正常細(xì)胞環(huán)境可以分解表面吸附的H2O2，重新暴露出CNP的活性催化位點(diǎn)以進(jìn)行下一輪的循環(huán)，從而降低了細(xì)胞中的ROS，減少了細(xì)胞的凋亡，降低了化療藥物的毒副作用；而在pH酸性的腫瘤細(xì)胞環(huán)境中，其表面吸附的H2O2反而會(huì)破壞活性催化位點(diǎn)的再暴露，阻止了其對(duì)ROS的清除，而不降低化療藥物的腫瘤殺傷能力。CNPs對(duì)于中性pH細(xì)胞的保護(hù)，是通過激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路，進(jìn)而提高SOD活性，提高抗氧化類基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)，從而達(dá)到降低ROS，減少細(xì)胞凋亡，減少腎損傷的作用。因此，CNPs有望擴(kuò)大化療的使用，讓更多癌癥病人從中獲益。
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