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【摘要】

最近，受磁鐵吸引金屬的啟發，同濟大學蔡明副教授/上海交通大學崔文國教授團隊共同利用金屬離子配體的配位反應構建了雙膦酸鹽功能化可注射水凝膠微球（GelMA-BP-Mg），該微球可以通過捕獲 Mg²⁺ 促進骨質疏松性骨缺損的松質骨重建。通過在 GelMA 微球上接枝雙膦酸鹽 (BP)，GelMA-BP 微球可以通過配位反應產生強大的 Mg²⁺ 捕獲能力和緩釋性能，而緩釋 BP 具有骨靶向特性。在可注射的 GelMA-BP-Mg 微球系統中，捕獲的 Mg²⁺ 的原子百分比為 0.6%，捕獲的 Mg²⁺ 可以有效釋放 18 天。

這些證明復合微球能夠有效地捕獲Mg²⁺，為復合微球激活成骨細胞和內皮細胞并抑制破骨細胞提供了基礎。體內外實驗結果表明，磁鐵激發的Mg²⁺捕獲復合微球通過刺激成骨細胞和內皮細胞同時抑制破骨細胞，有利于成骨和血管生成，最終有效促進松質骨再生。該研究可為基于金屬離子治療骨質疏松性骨缺損提供一些有意義的思路。相關論文以題為Capturing Magnesium Ions via Microfluidic Hydrogel Microspheres for Promoting Cancellous Bone Regeneration發表在《ACS Nano》上。
【圖文解析】

受磁鐵吸引金屬的自然現象啟發，團隊通過席夫堿反應和配位鍵在甲基丙烯腈酰化明膠（GelMA-BP）微球表面螯合Mg²⁺，以構建一種捕獲 Mg²⁺ 微流體水凝膠微球（GelMA-BP-Mg）受磁鐵啟發，賦予水凝膠微球主動捕獲 Mg²⁺、微創注射性、持續緩釋特性和骨靶向能力，從而增強其激活成骨細胞和 內皮細胞和抑制破骨細胞，最終通過“集成多用途”微球實現松質骨的重建（示意圖1）。

示意圖 1. (A) 微流體 GelMA-BP 微球的制備過程和捕獲 Mg²⁺的 GelMA-BP-Mg 微球的構建。(B) 具有“磁鐵”功能的可捕獲Mg²⁺的微流控GelMA-BP-Mg微球的構建及捕獲Mg2+的原理描述。

復合微球的制備與表征

SEM顯示GelMA-BP-Mg微球表面存在平均粒徑為79±15nm的BP-Mg納米顆粒，而GelMA-BP和GelMA微球表面不存在這種納米結構（圖1A）。能量色散 X 射線光譜 (EDS) 顯示 GelMA-BP 微球具有均勻的 P 元素分布，GelMA-BP-Mg 微球具有均勻的鎂元素分布（圖 1B）。此外，對于每組復合微球樣品，EDS 顯示SEM 觀察到的 GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 中存在相應的 P 元素和 Mg 元素（圖 1C）。³¹P NMR譜（圖1D）顯示只有GelMA-BP和GelMA-BP-Mg在17.6ppm處有明顯的共振峰。圖1E顯示了BP的累積釋放曲線。可以觀察到，在 GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 微球藥物釋放后的 12 天內，BP 的釋放速度較快，然后逐漸減慢。發布21天后，BP的發布趨于持平。圖 1F 顯示了 GelMA-BP-Mg 微球的 Mg²⁺ 累積釋放曲線。圖 1G 顯示系統中形成粒徑為 77±12 nm 的 BP-Mg 納米粒子，與圖 1G 中 SEM 顯示的 GelMA-BP-Mg 微球表面納米粒子基本相同。圖 1H 顯示了制備可捕獲 Mg²⁺ 的復合微球所涉及的化學方程式。

圖 1. 復合微球的特性。(A) GelMA、GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 微球在不同放大倍數下的典型掃描電子顯微鏡圖像。(B) 雙膦酸鹽在 GelMA-BP 微球上的均勻分布以及雙膦酸鹽和捕獲的 Mg²⁺ 在 GelMA-BP-Mg 微球上的均勻分布。(C) 能譜分析，證實復合微球上存在相應的 P 和 Mg 元素。(D) 三種復合微球的 31P 核磁共振譜。(E, F) 復合微球 BP 和 Mg²⁺ 的釋放曲線，證明了 BP 的成功接枝和 Mg²⁺ 的有效捕獲。(G) MgCl₂ 溶液、BP 溶液以及 MgCl2 和 BP 混合體系的 TEM 圖像。(H) 制備可捕獲 Mg²⁺的復合微球所涉及的化學方程式。

復合微球體外生物相容性

首先在24孔板中培養BMSCs和HUVECs細胞，然后用GelMA、GelMA-BP、GelMA-BP-Mg微球共培養BMSCs和HUVECs細胞。根據 1、3 和 5 天的活/死染色結果，復合微球對共培養的 BMSC 和 HUVEC 的毒性較小（圖 2AB、DE）。此外，CCK-8 結果進一步定量驗證了每組之間的細胞增殖活性（圖 2C、F）。定量統計分析表明復合微球具有良好的生物相容性。圖 3 和圖 S5A、B 的面板 A-E 是 BMSCs 和 HUVECs 細胞與 GelMA、GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 微球共培養 2、5 和 7 天的結果，以及定量分析 進行了細胞數。因此，這些結果表明，每組復合微球都具有良好的生物相容性。

圖 3. 復合微球的生物相容性。

(A, B) BMSCs 和 HUVECs 細胞在復合微球上的增殖行為，觀察了 2、5 和 7 天。(C)復合微球和細胞的共培養。紅色顯示骨架；藍色顯示核。(D)微球上細胞數的統計。

成管實驗

圖 4A 顯示，在給定的時間點，HUVEC 在每組復合微球樣品的提取物中培養。3小時和6小時后，GelMA-BP-Mg組的管形成更好，與GelMA-BP和GelMA組形成鮮明對比，表明復合微球釋放的Mg具有一定的血管生成活性。ImageJ 用于計算結的數量和形成的管的總長度。因此，結果表明，GelMA-BP-Mg 組的這些計算參數高于 GelMA-BP 和 GelMA 組，并且具有統計學意義（圖 4B、C）。

圖 4. 復合微球的體外血管化、體外礦化和破骨細胞抑制。(A) 經過 1、3 和 6 小時的培養，HUVEC 細胞形成內皮網絡。(B, C) 分析組間總長度 (B) 和節點數 (C) 的差異。(D) 不同微球復合物的骨髓間充質干細胞用茜素紅 S 染色的照片。(E) 不同微球復合物中破骨細胞的 TRAP 染色顯微鏡圖片。(F, G) 不同組茜素紅 S 染色和 TRAP 染色的定量分析。

Q-PCR 和蛋白質印跡評估

培養 24 小時后，GelMA-BP-Mg 組中 VEGF 和 e-NOS 的表達水平顯著高于 GelMA-BP 和 GelMA 組（圖 5A、B、E-G）。因此，這些結果證明團隊的復合GelMA-BP-Mg 微球可以有效地釋放 Mg²⁺以激活 e-NOS 和 VEGF 途徑，從而促進血管再生。

圖 5. 復合微球對 BMSCs 和 HUVECs 細胞中成骨基因和管基因表達的影響。(A-D) Q-PCR 顯示相關的 mRNA 表達。這些基因包括 Runx2、ALP、VEGF 和 e-NOS。(E-I) 蛋白質印跡探索蛋白質表達并進行定量分析。

復合微球體內骨再生評估和體內Mg²⁺捕獲性能

如圖 6A 所示，sham 組和 GelMA 組在 4 周和 8 周后沒有明顯的骨再生，而 GelMA-BP 和 GelMA-BP-Mg 的骨質量有一定程度的改善。最后，注射 GelMA-BP-Mg 的骨骼的 Tb.Th、BV/TV 和 BMD 顯著高于 GelMA 和 GelMA-BP 組（圖 6B-H）。EDS 顯示從骨缺損中獲得的 GelMA-BP 微球在 1 周和 2 周后在表面具有 Mg²⁺ 分布（圖 6I）。因此，結果證明 GelMA-BP 微球仍然可以有效地捕獲體內的 Mg²⁺。

圖 6. Micro-CT 評估了可注射復合微球對體內骨再生的影響。(A-C) 骨質疏松大鼠模型成功建立和定量分析。4 周和 8 周時骨質疏松性骨缺損大鼠股骨遠端的典型顯微 CT 圖像。(E-H) 不同治療組微 CT 參數的定量分析：(E) Bv/Tv、(F) Tb.Sp、(G) BMD 和 (H) Tb.Sp。(I) GelMA-BP微球注入骨缺損1周和2周后，EDS顯示微球表面Mg²⁺分布，證明GelMA-BP微球可有效捕獲體內Mg²⁺。

組織學評估

HE染色進一步驗證了復合微球促進松質骨再生的能力（圖7A、B）。CD31免疫熒光用于測試每組的第四周切片（圖7C，D）。團隊還通過I型膠原蛋白的免疫組織化學染色對骨缺損處新形成的骨組織進行了組織學分析（圖7E，G），和結果與其他研究相似。定量分析結果顯示，對照組骨缺損仍較明顯，而注射GelMA-BP和GelMA-BP-Mg微球組的松質骨重建較多。特別是注射GelMA-BP-Mg微球的大部分缺陷都可以治愈。因此，微球復合物具有優異的成骨作用，與 GelMA-BP 和 GelMA 相比，GelMA-BP-Mg 具有更強的松質骨再生能力。

圖 7. 復合微球體內治療的組織學分析。(A)每組治療 8 周的骨組織切片 HE 染色的代表性圖片。(B)不同組中小梁骨面積的百分比。(C)手術后 8 周拍攝的股骨組織切片的代表性圖片，用于I型膠原蛋白的免疫組織化學染色。(D) I 型膠原陽性細胞的定量。(E, F) 每組 CD31 表達變化的免疫熒光染色，以及蛋白質表達差異的量化。

【總結】

受磁鐵吸引金屬的自然現象的啟發，該團隊通過席夫堿反應性和配位鍵螯合了接枝BP的GelMA-BP微球表面的Mg²⁺。因此，構建了一種具有“磁鐵”功能的可捕獲Mg²⁺的微流控GelMA-BP-Mg微球，賦予水凝膠微球主動捕獲Mg²⁺、微創注射性、持續緩釋特性和骨靶向能力，從而增強其激活成骨細胞和內皮細胞以及抑制破骨細胞的能力，最終通過“一體化多用途”微球實現松質骨的重建。顯然，在 GelMA 微球上接枝 BP 使 GelMA-BP 微球具有強大的 Mg²⁺捕獲性能和緩釋性能。GelMA-BP-Mg 復合微球在體外實驗中顯示出優異的 Mg²⁺捕獲和釋放性能、血管化能力、成骨潛力和破骨細胞抑制能力。進一步證明捕獲Mg²⁺的復合微球可促進大鼠骨缺損處松質骨的再生。團隊相信這種基于“磁鐵”這一自然現象能夠捕獲Mg²⁺的復合微球，將為臨床骨質疏松性骨缺損修復提供一個有意義的概念。

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